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关于新型冠状病毒核酸检测阳性率低的一点看法

作者 王成彬 来源 中华医学会检验医学分会主任委员 点击率 2682 添加时间 2020/2/10

近期有媒体及专家反映新型冠状病毒核酸检测阳性率低、有的病例重复检测多次阴性后出现阳性结果、咽拭子标本多次检测阴性但最后在呼吸道灌洗液标本中检测出阳性结果、CT影像筛查出现新型冠状病毒肺炎特征但核酸检测阴性等问题。经过与临床分子诊断学专家、临床检验医学专家、临床呼吸病医学专家、临床影像医学专家交流,现提出自己的一点看法。



一、关于核酸检测在新型冠状病毒肺炎患者诊断中的应用


新型冠状病毒肺炎(Novel Coronavirus Pneumonia, NCP)是由2019新型冠状病毒(2019 Novel Coronavirus, 2019-nCoV)感染引起的一种急性传染性疾病,而确定诊断的金标准就是能在患者体内找到2019-nCoV的存在。核酸检测就是检测2019-nCoV基因中某些特定核酸序列的存在,因此从方法学层面考虑其作为实验室诊断金标准没有任何疑问,而CT(电子计算机断层扫描)作为临床影像学筛查指标具有重要价值,但无论从早期诊断、鉴别诊断、排除诊断还是最终确诊等方面都还具有一定的局限性,更无法替代病原学诊断。其实任何疾病本身都具有分层诊断的概念,在感染性疾病的诊断中,临床表现、流行病学史、影像学、病原学等指标都发挥重要作用,但病原学诊断肯定是最精准的诊断。当然我们在重视核酸检测在病毒感染诊断中的重要价值的同时,也要客观考虑由于其方法学特点、疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输、核酸提取、扩增体系、人员操作等因素都可能造成最后检测结果的假阴性或假阳性。



二、关于2019-nCoV核酸检测方法


目前,无论是临床实验室还是疾病控制中心(CDC)实验室,普遍应用的是实时荧光RT-PCR方法,此检测方法成熟可靠,并已在常规检验和科研实验中被广泛应用。该方法是将标本中的特定核酸序列进行扩增,理论上每一次扩增后的核酸数量都是成倍增加,经过30次以上扩增后,其核酸数量达到足够通过荧光等常规方法进行检测。如果有人说目前实验室所用2019-nCoV核酸检测方法不可靠,可能是因为其对该方法原理和临床应用不了解。实时荧光RT-PCR方法从采集标本送到实验室,经过对标本的接收、处理(有时从安全考虑需要灭活处理,这点对于生物安全至关重要,但也有专家提出可能影响检测效率)、病毒核酸提取、核酸扩增、数据处理及报告,一般需要约4个小时或更长时间,如何改进核酸提取和扩增流程,缩短整个检测时间是迫切需要解决的问题。目前也有个别厂家的检测试剂检测的不是2019-nCoV核酸而是病毒进入机体后机体产生的抗体,病毒进入机体到机体产生特异性的抗体需要一段时间(窗口期),因此检测到病毒抗体肯定滞后于检测到病毒核酸。病毒抗体检测一般用于筛查手段及流行病学调查,其敏感性、特异性、临床应用效率还需要进一步的验证和评估。



三、2019-nCoV核酸检测阳性率低等问题



(一)患者的病程与病情:NCP患者的发病都会经历一个从感染后无症状,到轻度症状出现,再到严重症状出现的过程。不同病程、不同病情患者机体中的病毒存在量可能不同(已有病毒感染,但由于在相关部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少,以致于现有方法检测不到,也称窗口期)。因此,对临床高度疑似NCP患者,应该连续采集标本进行核酸检测(这可能是临床患者多次检测阴性,阳性结果出现晚的主要原因之一)。其实任何病原学检测,都不能只根据一次阴性结果而做出排除性诊断,更不能根据核酸检测阴性而漏诊临床高度疑似的NCP患者,尤其在高发地区,在大面积流行期间。


(二)标本采集、运输及保存

1、标本采集部位:很多专家从实践工作中总结出的经验认为,鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子,下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本(这也是这两天被广泛评论的某患者咽拭子标本三次核酸检测阴性,收住院后在抢救过程中采集肺泡灌洗液标本核酸检测阳性的原因),但下呼吸道的痰、肺泡灌洗液标本采集难度大、易引起患者喷射导致采集操作者感染风险大,一般情况不建议使用(气管切开、上呼吸机抢救病人可用)。近期发布的第五版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》已将标本采集“咽拭子”更新为“鼻咽拭子”。为了提高检测阳性率,建议采集同一病人多部位标本,合并进行检测。比如,用口咽拭子、鼻咽拭子同时采集标本,然后放到同一采集管中送检。对于有消化道症状的疑似患者,同时采集粪便或肛拭子进行检测。


2、标本采集方法:近期用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子,采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。如果平时医护人员咽拭子取样不多,刮取标本时患者的反应又比较大,往往导致刮取标本的位置不对,或力度和时间不够,没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少,最后导致检测结果阴性。


3、标本运输及保存条件:2019-nCoV为RNA病毒,很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解,而影响最后的检测效率。严格来讲标本采集后应及时送到实验室(疾控中心、医院检验科、第三方实验室),尽快完成检测。标本在常温条件下放置时间过长(几个小时、十几个小时、二十多个小时或更长时间),也可能是造成最后检测结果假阴性的原因。近期有人提出使用防病毒核酸降解标本采集管,但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。建议标本采集后及时送检,及时检测(4小时)。如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测,应将其置于4℃保存(24小时)。24小时内不能检测的标本,建议于-70℃以下保存并避免反复冻融。


(三)核酸检测试剂

1、核酸提取:上面已叙述过2019-nCoV核酸检测需要对所采集标本中核酸进行提取。目前临床实验室所用方法有手工提取和机器自动或半自动提取,通常情况下机器自动提取方法的效率要优于手工提取。而不同提取试剂和手工提取流程的掌控对最后提取到的核酸数量和质量可能存在差别,而从标本中所提取出的核酸数量和质量对于检测方法中下一个步骤核酸扩增至关重要,从而也就直接影响最后的检测结果。


2、核酸扩增试剂:由于不同厂家试剂研发是根据2019-nCoV核酸Orf1ab、N、E、S等基因的特异性序列设计的扩增探针(不同厂家的扩增试剂可分为1个、2个或3个靶标基因位点检测试剂),试剂中酶、金属离子等成分与质量的差异,都可能影响扩增效率和最后检测结果的灵敏度。


3、试剂应用的特殊性:由于导致本次疫情的是2019-nCoV,加上其突发性,试剂生产商只能根据有限公开的病毒核酸研究数据开展试剂研发,国家相关部门最早推荐了一些厂家的检测产品,后来又审批了一些厂家检测试剂的注册申请。目前开展2019-nCoV检测试剂研发生产的厂家已超过百家,正常情况下一个临床检测试剂产品从研发到应用需要通过一系列的临床验证与评估,但由于本次疫情的特殊性,时间的紧迫性,所研发试剂来不及完成正常流程,特别是无法得到一定数量临床患者标本的验证。对于临床某些高度疑似病例,或检测结果难以确定病例,建议用2种以上试剂进行检测、验证。


(四)核酸扩增仪器:目前不同实验室用于2019-nCoV核酸检测的仪器(PCR仪或核酸扩增仪)种类有所不同,价格上从几万、十几万、数十上百万不等,不同的设备对检测过程中不同温度的控制精度、对荧光信号检测敏感度等不同,从而可能导致检测结果的差异。


以上是对近期媒体及专家反映2019-nCoV核酸检测阳性率低等问题其可能原因的一些分析,由此可以理解,目前2019-nCoV核酸检测中各种原因引起的这样或那样的问题是现实存在的,也是难以避免的。我们不能因为这些问题的存在而普遍怀疑、甚至否定目前实验室2019-nCoV核酸检测结果。目前2019-nCoV核酸检测大多在三级医院或CDC二级以上实验室开展,这些实验室的管理水平、技术人员素质、检验设备的先进程度、检验过程的质量控制措施等方面可以说大都是处于国际先进水平,而各实验室也在通过工作开展中的回顾总结或通过实验室之间的经验交流,不断改进、完善2019-nCoV核酸检测方法。


近期中华医学会检验医学分会也组织了相关方面专家对2019-nCoV核酸检测进行了探讨,并出台了2019-nCoV核酸检测相关专家共识,同时一些新的基因检测平台也在不断研发。随着基因测序、数字PCR、RT-PCR毛细管电泳等技术的应用(国家卫健委发布的“新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案--试行第五版 修正版”中已将病毒基因测序与实时荧光RT-PCR核酸检测列为实验室确诊方法),2019-nCoV核酸检测中的问题肯定会得到持续改进。

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